1.1. Настоящие методическиеуказания устанавливают методы санитарно-микробиологического контроля качествапитьевой воды в отношении ее эпидемической безопасности по показателям СанПиН2.1.4.559-96 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству водыцентрализованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».
1.2. Методические указанияпредназначены для лабораторий организаций, предприятий и иных хозяйственныхсубъектов, осуществляющих производственный контроль, а также органовсанитарно-эпидемиологической службы, обеспечивающих государственный иведомственный санитарно-эпидемиологический надзор за качеством питьевой водыцентрализованных систем питьевого водоснабжения.
2. Нормативные ссылки
2.1. Санитарные правила инормы. «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству водыцентрализованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества». СанПиН2.1.4.559-96.
2.2.Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групппатогенности и гельминтами». СП 1.2.731-99.
2.3. ГОСТ18963-73. Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа.
3. Отбор, хранение и транспортирование проб
3.1. Общие требования котбору проб
3.1.1. Отбор проб производит специалистпосле прохождения инструктажа по технике выполнения отбора проб длямикробиологического анализа.
3.1.2. Для отбора проб водыиспользуют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду илиемкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих нажизнедеятельность микроорганизмов.
3.1.3. Емкости должны бытьоснащены плотно закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми или из другихматериалов) и защитным колпачком (из алюминиевой фольги, плотной бумаги).Многоразовая посуда, в т.ч. пробки, должна выдерживать стерилизацию сухим жаромили автоклавированием.
3.1.4. При отборе проб водной и той же точке для различных целей первыми отбирают пробы длябактериологических исследований. Если отбирают воду после обеззараживанияхимическими реагентами, то для нейтрализации остаточного количествадезинфектанта в емкость, предназначенную для отбора проб, вносят достерилизации натрий серноватисто-кислый в виде кристаллов из расчета 10 мг на500 мл воды.
3.1.5. Пробу отбирают встерильные емкости. Емкость открывают непосредственно перед отбором, удаляяпробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края емкости недолжны чего-либо касаться. Ополаскивать посуду запрещается.
3.1.6.При исследовании воды из распределительных сетей отбор проб из крана производятпосле предварительной его стерилизации обжиганием и последующего спуска воды неменее 10 мин при полностью открытом кране. При отборе пробы напор воды можетбыть уменьшен. Пробу отбирают непосредственно из крана без резиновых шлангов,водораспределительных сеток и других насадок. Если через пробоотборный кранпроисходит постоянный излив воды, отбор проб производят без предварительногообжига, не изменяя напора воды и существующей конструкции (при наличии силиконовыхили резиновых шлангов).
При заполнении емкостейдолжно оставаться пространство между пробкой и поверхностью воды, чтобы пробкане смачивалась при транспортировании.
После наполнения емкостьзакрывают стерильной пробкой и колпачком.
3.1.7. Отобранную пробумаркируют и сопровождают документом отбора проб воды с указанием места, даты,времени забора, фамилии специалиста, отбиравшего пробу, и другой информации.
3.2. Хранение и транспортирование проб
3.2.1. Доставку проб питьевойводы осуществляют в контейнерах-холодильниках при температуре (4 — 10) °С. Вхолодный период года контейнеры должны быть снабжены термоизолирующимипрокладками, обеспечивающими предохранение проб от промерзания. При соблюденииуказанных условий срок начала исследований от момента отбора проб не долженпревышать 6 ч.
Если пробы нельзя охладить,их анализ следует провести в течение 2 ч после забора.
Если не может быть соблюденовремя доставки пробы и температура хранения, анализ пробы проводить не следует.
Пробы питьевой воды должныдоставляться в отдельных продезинфицированных контейнерах.
4. Оборудование, расходные материалы, реактивы,питательные среды
4.1. Оборудование
Термостат длятемпературного режима (37 ± 1) °С
Термостат длятемпературного режима (44 ± 1) °С
Термостат или водяная банядля температурного режима (44 ± 0,5) °С
Водяная баня длятемпературного режима (75 ± 5) °С
Водяная баня или термостатдля температурного режима (45 — 49) °С (для питательных сред)
Прибор для мембраннойфильтрации под вакуумом с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мми устройство для создания разрежения (0,5 — 1,0) атм
Весы лабораторные общегоназначения 4 кл. точности, с пределом взвешивания до 1000 г
ГОСТ 24104-80
Максимальный термометрртутный с диапазоном измерения от 20 до 200 °С с ценой деления шкалы 1 °С
Термометр ртутный сдиапазоном измерения от 0 до 100 °С с ценой деления шкалы 0,5 °С
рН-метр, обеспечивающийизмерение с погрешностью до 0,01
Дистиллятор, обеспечивающийкачество дистиллированной воды не ниже
ГОСТ 6709-72
Стерилизатор суховоздушныйдля температурного режима (180 ± 5) °С
Стерилизатор паровой
Холодильник бытовойэлектрический
Вытяжной шкаф для работы схлороформом при проведении анализа на колифаги
Нагревательный прибор дляварки питательных сред либо магнитные мешалки с подогревом до 300 °С
Прибор для счета колонийбактерий
Лупа с двукратнымувеличением
Дозаторы для разливапитательных сред
Дозаторы пипеточные
Облучатель бактерицидный
Оптический стандартмутности на 10 ед.
Горелки газовые или спиртовки
Петли бактериологические
Поплавки бактериологические
Пинцеты для работы смембранными фильтрами
Штативы для пробирок
Емкости эмалированные
4.2. Расходные материалы
Мембранные фильтры для микробиологическихцелей с диаметром пор не более 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм идругие фильтрующие мембраны с аналогичной способностью фильтрации, имеющиесертификат качества
Индикаторы бумажные дляопределения рН в диапазоне 6 — 8 с интервалом определения 0,2 — 0,3
Фольга алюминиевая,колпачки силиконовые, металлические
Пипетки, вместимостью 1,5,10 мл с ценой деления 0,1 мл многоразового или одноразового использования)
ГОСТ 29227-91
Пробирки (многоразового илиодноразового использования)
ГОСТ 25336-82
Цилиндры, вместимостью 100,250, 500 мл или мензурки, вместимостью 250, 500, 1000 мл
ГОСТ 1770-74
Чашки бактериологические(Петри)
ГОСТ23932-90
Воронки стеклянные
ГОСТ 25336-82
Пробки (силиконовые,резиновые и другие, выдерживающие стерилизацию сухим жаром или автоклавированием)
Бумага фильтровальнаялабораторная
ГОСТ 12026-76
Вата хлопковая медицинскаягигроскопическая
ГОСТ 5556-81
Марля медицинская
ГОСТ 9412-77
Карандаши или фломастеры постеклу
Лейкопластырь
Перчатки резиновые
4.3. Химические реактивы
Все химические реактивы должны соответствовать квалификации не ниже ч.д. а.
Железо серно-кислоезакисное (7-водное)
ГОСТ 4148-78
Бромтимоловый синий
ТУ 6-09-20-86-77
Кислота соляная
ГОСТ 3118-77
Натрий серноватисто-кислый(тиосульфат натрия) 5-водный
ГОСТ 27068-86
Натрий хлористый
ГОСТ 4233-77
Натрий гидрат окиси
ГОСТ 4328-77
Калий гидрат окиси
ГОСТ 24363-80
Спирт этиловыйректификованный медицинский
ГОСТ 5962-67
Спирт этиловый технический
ГОСТ 18300-87
Глюкоза
ГОСТ 6038-79
Лактоза
ГОСТ 6038-74
Натрий сернисто-кислый(сульфит натрия)
ГОСТ 903-76
α-нафтол*
ГОСТ 5838-79
Розоловая кислота
Фенилендиаминовыесоединения* (тетраметил-п-фенилендиамин гидрохлорид, диметил-п-фенилендиаминсоляно-кислый)
Фуксин основной*
ТУ 6-09-4119-75
Хлороформ технический*
ГОСТ 20015-76
Стрептомицин стерильный
ГОСТ 4159-64
Йод кристаллический
ГОСТ 4232-65
Калий йодистый
Генциан фиолетовыйкристаллический
Фенол
ГОСТ 6417-72
Примечание.
* Вещества обладают канцерогенными мутагенным действием, работа с ними требует соблюдения мер предосторожности.
4.4. Питательные среды
Агар Эндо сухой
Агар микробиологический
ГОСТ 17206-84
Агар питательный сухой
ТУ 42-14-33-75
Сухой препарат с индикаторомВР и лактозой или среда Гисса с лактозой
Сухой питательный бульон
Пептон сухой ферментативныйдля бактериологических целей
ГОСТ 13805-76
Системы индикаторныебумажные (СИБ)
·СИБ-лактоза
·СИБ-оксидаза
Допускаются к использованиюкоммерческие питательные среды, диагностические препараты и системыидентификации производства зарубежных фирм, предназначенные для целейописываемых методов. Питательные среды и биологические препараты зарубежногопроизводства должны иметь международный сертификат качества ISO 9000или EN 29 000.
При использовании следуетруководствоваться рекомендациями фирмы-производителя.
Все обезвоженные коммерческиепитательные среды и препараты отечественного производства должны иметь сертификатсоответствия.
4.5. Тест-культуры микроорганизмов
4.5.1. Контрольный колифагМ82, штамм ВКПМ-3254 Е. coli К12 F+ Strr получают в ГНИИ Генетика -Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ — Россия, 113545, г.Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1).
4.5.2. Штамм Е. coliМ17-02 и один из штаммов: Pseudomonas aeruginosaили Pseudomonas fluorescens получают в ГосударственномНациональном Органе контроля медицинских и биологических препаратов им. Л. А.Тарасовича Минздрава России (Россия, 121002, г. Москва, ул. Сивцев-Вражек, д.41).
Примечание.
В производственныхлабораториях, расположенных на территории водопроводных станции, следуетиспользовать штамм Pseudomonas fluorescens.
5. Приготовление питательных сред и реактивов
5.1. Общие положения
Предпочтительно использованиестандартизованных сухих питательных сред промышленного производства.
При использованиипромышленных сухих питательных сред их приготавливают в соответствии суказаниями изготовителя на этикетке.
В этом случае следуетсоблюдать способ применения и срок хранения питательных сред, указанные наупаковках.
Сухие питательные средыхранят в сухих помещениях, в темноте, при комнатной температуре. Открытыеупаковки тщательно закупоривают. Среды с измененным внешним видом (уплотненные,с комками), а также с истекшим сроком годности не используют.
Для приготовления растворов,реактивов и питательных сред применяют воду дистиллированную по ГОСТу 6709-72.
Питательные среды готовят впосуде из инертного материала.
Учитывая возможное изменениерН питательных сред после кипячения и стерилизации, окончательный контроль рНпроводят в готовой среде при температуре 25 °С с использованием индикаторнойбумаги.
После стерилизациипитательные среды оставляют для охлаждения при комнатной температуре. Принеобходимости розлива в чашки Петри среды охлаждают до температуры (50 — 60)°С.
Температура сред, хранящихсяв холодильнике, перед посевом должна быть доведена до комнатной.
5.2. Питательный бульон
5.2.1.Готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанномуна этикетке.
5.2.2. Питательныйбульон (десятикратный) для колифагов готовят путем увеличения в 10 разнавески сухого препарата, указанной на этикетке.
5.3. Питательный агар
5.3.1.Готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанномуна этикетке.
5.3.2.Питательный агар для определения колифагов прямым методом готовят, увеличиваянавеску сухого препарата в 2 раза от прописи.
5.3.3. Питательный агарзапрещается выдерживать в расплавленном состоянии более 8 ч. Оставшийсянеиспользованным агар повторному расплавлению не подлежит.
5.3.4.Полужидкий питательный агар готовят следующим образом: сухой питательный бульон(15 г) и агар микробиологический (3 г) растворить при нагревании в 1000 млдистиллированной воды. Довести рН до 7,0 — 7,2, разлить в пробирки истерилизовать автоклавированием при 121 °С в течение 15 мин.
5.3.5.Питательный агар со стрептомицином готовят из расчета содержания 100 мкгстрептомицина на 1 мл питательного агара, приготовленного по стандартнойпрописи. Стерильно на стерильной дистиллированной воде готовят растворстрептомицина в концентрации 10 мг на 1 мл. В готовый питательный агар,отмеренный по объему и остуженный до температуры (45 — 49) °С, вносятприготовленный стерильный раствор стрептомицина из расчета 0,1 мл на 10 млпитательного агара. Разливают в пробирки для приготовления скошенного агара.Повторное расплавление питательной среды со стрептомицином запрещается.
5.4. Фуксин-сульфитная среда Эндо
5.4.1.Основная модификация
Готовят из сухого препаратапо способу, указанному на этикетке. Если на поверхности среды заметны следывлаги, чашки перед посевом необходимо подсушить. Срок хранения чашек со средой неболее 2 — 3 суток в темноте, если производителем не оговорены другие сроки.
5.4.2. Повышениедифференцирующих свойств среды
Для повышениядифференцирующих свойств среды в готовую и охлажденную до (60 — 70) °С средуперед разливкой в чашки допускается прибавлять на 100 мл среды 0,2 мл 5 %-ногоспиртового раствора основного фуксина. Срок хранения раствора фуксина — неболее 1 мес.
5.4.3. Модификация среды сдобавлением розоловой кислоты
В случаях, когда мембранные фильтрызарастают микрофлорой, не относящейся к бактериям кишечной группы, помимофуксина, допускается добавление на 100 мл среды Эндо 0,2 мл 5 %-ного спиртовогораствора розоловой кислоты. Срок хранения раствора розоловой кислоты — не более1 мес.
Модификацию среды Эндо сдобавлением розоловой кислоты используют только при работе методом мембраннойфильтрации.
5.5. Лактозо-пептонная среда
10 г пептона, 5 г натрияхлористого, 5 г лактозы растворяют при нагревании в 1 л дистиллированной воды.После растворения ингредиентов устанавливают рН 7,4 — 7,6, разливают по10 мл в пробирки, стерилизуют при (112 ± 2) °С 12 мин.
Для приготовленияконцентрированной лактозо-пептонной среды все ингредиенты, кроме воды,увеличивают в 10 раз, разливают по 1 мл в пробирки и по 10 мл во флаконы.
5.6. Питательные среды для подтверждения способностиферментировать лактозу до кислоты и газа
5.6.1. Полужидкая среда с лактозой из сухогопрепарата
Готовят по способу,указанному на этикетке.
Срок хранения — не более 2недель при комнатной температуре.
Посев производят уколом додна пробирки. При образовании кислоты цвет питательной среды изменяется всоответствии с использованным индикатором. При газообразовании газ скапливаетсяили по уколу, или на поверхности, или в толще среды появляются разрывы. Приинкубации посевов более 5 ч газ может улетучиться. В таких случаях наприсутствие газа указывают оставшиеся в толще среды «карманы» — потемнениясреды на месте бывшего пузырька газа.
5.6.2. Полужидкая среда с лактозой
Готовят при отсутствии сухогопрепарата.
В 1 л дистиллированной водырастворяют 10 г пептона, 5 г натрия хлористого, (4 — 5) г агар-агара, доводятдо кипения, устанавливают рН 7,2 — 7,4, добавляют 1 мл 1,6 %-ного спиртовогораствора бромтимолового синего. Стерилизуют при (120 ± 2) °С 20 мин. Врасплавленную среду вносят 5 г лактозы, нагревают до кипения, разливают встерильные пробирки на высоту (3 — 5) см и стерилизуют при (112 ± 2) °С 12 мин.Срок хранения — не более 2 недель при комнатной температуре.
Правильно приготовленнаясреда зеленого цвета с синеватым оттенком (цвет бутылочного стекла). ПриОбразовании кислоты цвет среды изменяется на желтый.
5.6.3. Лактозо-пептонная среда
Готовят по п. 5.5 сдобавлением 1 мл 1,6 %-ного спиртового раствора бромтимолового синего на 1 л иразливают по (3 — 5) мл в пробирки с поплавком.
5.6.4. СИБ-лактоза
Готовят по прописизавода-изготовителя.
5.7. Реактивы для оксидазного теста
5.7.1.Вариант 1
1 %-ный водный раствортетраметил-п-фенилендиамина гидрохлорид. Готовят перед употреблением.
5.7.2.Вариант 2
Реактив № 1.1 %-ный спиртовой растворα-нафтола.
Реактив № 2.1 %-ный водный растворфенкпендиаминового соединения.
Растворы сохраняют в темныхфлаконах с притертыми пробками:
1 — до одного месяца, 2 — доодной недели. Перед употреблением к трем частям первого раствора добавляют семьчастей второго раствора.
Могут быть использованыкоммерческие тест-системы для постановки оксидазного теста (СИБ-оксидаза илианалоги).
Перед работой с каждой сериейпроб реактивы или тест-системы на оксидазу следует испытывать с тест-культурамимикроорганизмов, дающих положительную (Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens) и отрицательную оксидазнуюреакцию (E. coli).
5.8. Железо-сульфитный агар
В 1000 мл стерильногорасплавленного питательного агара (по п. 5.4) добавляют 10 г глюкозы,нагревают до растворения, разливают мерно во флаконы, автоклавируют при (112 ±2) °С 12 мин (основная среда).
20 %-ный раствор сульфитанатрия (Na2SO3) и 8 %-ный раствор железасерно-кислого закисного (FeSO4) или железа хлористого (FeCl2) готовят непосредственноперед употреблением в стерильной посуде на стерильной дистиллированной воде.Раствор сульфита натрия нагревают до полного растворения. Перед выполнениеманализа в 100 мл расплавленной основной среды вносят 5 мл 20 %-ного растворасульфита натрия, перемешивают, затем вносят 1 мл 8 %-ного раствора сернокислогожелеза, перемешивают и стерильно разливают в пробирки высоким столбиком (12 -15) см для работы методом мембранной фильтрации или во флаконы для работыметодом прямого посева.
5.9. Реактивы для окраски препаратов по Граму
5.9.1. Карболовый растворгенциана фиолетового готовят следующим образом: 1 г генциана фиолетового,10 мл ректификованного этилового спирта, 5 г фенола растирают в ступке,добавляя 100 мл дистиллированной воды.
5.9.2. Раствор Люголяготовят следующим образом: 1 г йода, 2 г йодистого калия растворяют в 300 млдистиллированной воды. Хранить во флаконе из темного стекла.
5.9.3. Фуксин Циляготовят следующим образом: 1 г основного фуксина, 10 мл спирта этиловогоректификованного, 54 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 млдистиллированной воды.
6. Подготовка к анализу
6.1. Подготовка посуды и материалов
Лабораторную посуду моют,ополаскивают сначала водопроводной, затем дистиллированной водой и высушивают.
Пробирки, колбы, бутылки,флаконы закрывают силиконовыми или ватно-марлевыми пробками и колпачками (силиконовые,металлические, из фольги или плотной бумаги).
Пипетки со вставленнымитампонами из ваты укладывают в металлические пеналы или заворачивают в бумагу.
Чашки Петри укладывают вметаллические пеналы или заворачивают в бумагу. Бумага, используемая дляобертывания лабораторной посуды, не должна разрушаться при стерилизации.
Подготовленную посудустерилизуют в сушильном шкафу при температуре 160 °С в течение 2 ч или 180 °С 1ч, считая с момента достижения указанной температуры. Стерильную посуду вынимаютиз стерилизационного шкафа после его охлаждения ниже 60 °С. Срок хранениястерильной посуды — не более 10 дней.
Материалы и лабораторнуюпосуду, разрушающиеся при температуре (160 — 180) °С (резина и т.п.), следуетстерилизовать в паровом стерилизаторе при температуре (121 ± 2) °С 20 мин.
Новые резиновые пробкикипятят в 2 %-ном растворе натрия двууглекислого 30 мин и 5 раз промываютводопроводной водой (кипячение и промывание повторяют дважды). Затем пробкикипятят в дистиллированной воде 30 мин, высушивают, заворачивают в бумагу илифольгу и стерилизуют в паровом стерилизаторе. Резиновые пробки, использованныеранее, обеззараживают, кипятят 30 мин в водопроводной воде с нейтральным моющимсредством, промывают в водопроводной воде, высушивают, монтируют и стерилизуют.
После выполнения анализа всеиспользованные чашки, пробирки и пипетки обеззараживают в автоклаве при (126 ±2) °С в течение 60 мин, в исключительных случаях допускается обеззараживаниекипячением в 2 %-ном растворе пищевой соды или 0,5 %-ном моющего средства втечение 60 мин с момента закипания (в закрытой емкости с полным погружением враствор).
6.2. Подготовка проб воды
Перед посевом пробу тщательноперемешивают и фламбируют горящим тампоном край емкости. Используемые пробиркии чашки маркируют.
Перед каждым отбором новойпорции воды для анализа пробу перемешивают стерильной пипеткой.
7. Методика работы при использовании мембранных фильтров
7.1. Подготовка мембранныхфильтров
Мембранные фильтры должныбыть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями изготовителя.
7.2. Подготовка фильтровального аппарата
Воронку и столикфильтровального аппарата обтирают марлевым (ватным) тампоном, смоченным спиртомректификованным, и фламбируют. После охлаждения на столик фильтровальногоаппарата кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимаютего воронкой.
7.3. Фильтрование воды
В воронку прибора дляфильтрования наливают отмеренный объем воды, затем создают вакуум.
При посеве нескольких объемоводной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат безобеззараживания сначала меньшие, а затем большие объемы воды, меняя каждый разфильтры. Перед фильтрованием каждой новой пробы прибор обеззараживают.
Следует начинать сфильтрования проб обеззараженной воды или тех проб, которые предположительно незагрязнены, а затем фильтровать загрязненные пробы.
При фильтровании 1 млисследуемой воды следует в воронку налить предварительно не менее 10 млстерильной воды, а затем внести анализируемую воду.
После окончания фильтрованияи осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожноподнимают за край фламбированным пинцетом и переносят его, не переворачивая, напитательную среду, разлитую в чашки Петри, избегая пузырьков воздуха междусредой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна бытьобращена вверх.
Под каждым фильтром на днечашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, номера пробы идаты посева. На одну чашку можно поместить 3 — 4 фильтра с условием, чтобыфильтры не соприкасались.
8. Проведение анализа
8.1. Определение общегочисла микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре
8.1.1. Определение понятияпоказателя
Метод определяет в питьевойводе общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробныхмикроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре притемпературе 37 °С в течение 24 ч, видимые с увеличением в 2 раза.
8.1.2. Выполнение анализа
Из каждой пробы делают посевне менее двух объемов по 1 мл.
После тщательногоперемешивания пробы воды вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри, слегкаприоткрывая крышки. После внесения воды в каждую чашку вливают (8 — 12) мл (начашку диаметром 90 — 100 мм) расплавленного и остуженного до (45 — 49) °С питательногоагара после фламбирования края посуды, в которой он содержится. Затем быстросмешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегаяобразования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку чашки. Этупроцедуру производят на горизонтальной поверхности, где чашки оставляют дозастывания агара.
Расплавленный агар на периодпроведения анализа помещают в водяную баню или термостат, поддерживающиетемпературу (45 — 49) °С.
После застывания агара чашкис посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре (37 ±1) °С в течение (24 ± 2) ч.
8.1.3. Учет результатов
Подсчитывают все выросшие начашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Учитывают только те чашки,на которых выросло не более 300 изолированных колоний.
Количество колоний на обеихчашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующихединиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды.
Если на одной из 2 чашекподсчет невозможен, результат выдают на основании учета колоний на одной чашке.Если на двух чашках имеет место рост расплывчатых колоний, нераспространяющийся на всю поверхность чашки, или выросло более 300 колоний ианализ нельзя повторить, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом навсю поверхность. В этих случаях в протоколе отмечают «число КОЕ/мл -ориентировочно».
Если подсчет колоний начашках невозможен, то в протоколе отмечают «сплошной рост».
8.2. Определение общих и термотолерантныхколиформных бактерий методом мембранной фильтрации (основной метод)
8.2.1.Определение понятия показателя
Общие колиформные бактерии(ОКБ) -грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способныерасти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты,альдегида и газа при температуре (37 + 1) °С в течение (24 — 48) ч.
Термотолерантные колиформныебактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми ихпризнаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегидаи газа при температуре (44 ± 0,5) °С в течение 24 ч.
8.2.2. Принцип метода
Метод основан на фильтрацииустановленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов надифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификацииколоний по культуральным и биохимическим свойствам.
8.2.3. Выполнение анализа
8.2.3.1. Порядок исследования
При исследовании питьевойводы анализируют 3 объема по 100 мл.
При получении стабильныхотрицательных результатов допустима фильтрация 300 мл воды через один фильтр.
При фильтрации водынеизвестного качества целесообразно увеличение количества фильтруемых объемовдля получения изолированных колоний на фильтре (например, 10, 40, 100, 150 млводы).
Отмеренный объем водыфильтруют через мембранные фильтры с соблюдением требований, изложенных в п. 7.
Фильтры помещают на средуЭндо, приготовленную по п. 5.4. Чашки с фильтрами ставят в термостат дномвверх и инкубируют посевы при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 2) ч.
Если на фильтрах нет ростаили выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые,выдают отрицательный ответ: отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 мл исследуемой воды.Анализ заканчивают через 24 ч.
Если на фильтрах обнаруженрост изолированных типичных лактозоположительных колоний: темно-красных,красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колонийс отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типаотдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ.
Для подтверждения наличия ОКБисследуют:
· все колонии, если на фильтрахвыросло менее 5 колоний;
· не менее 3 — 4 колонийкаждого типа.
Для подтверждения наличия ТКБисследуют все типичные колонии, но не более 10.
Каждую выбраннуюизолированную колонию исследуют на:
· наличие оксидазнойактивности;
· принадлежность к Граму(микроскопия окрашенного по Граму препарата или постановка теста Грегерсена);
· ферментацию лактозы докислоты и газа.
8 2.32. Постановка оксидазного теста
Полоску фильтровальной бумагипомещают в чистую чашку Петри и смачивают 2 — 3 каплями реактива дляоксидазного теста по п. 5.7. Готовые бумажные системы смачиваютдистиллированной водой. Часть изолированной колонии стеклянной палочкой илиплатиновой петлей (металлическая петля из нихрома может дать ложноположительнуюреакцию) наносят штрихом на подготовленную фильтровальную бумагу. Реакциясчитается положительной, если в течение 1 мин появляется фиолетово-коричневое (п. 5.7.1вариант 1) или синее (п. 5.7.2 вариант 2 и СИБ-оксидаза) окрашиваниештриха. При отрицательной реакции цвет в месте нанесения культуры не меняется.При положительном результате эту колонию из дальнейшего исследования исключают.
Если при исследованииколоний, окрашенных в темно-красный цвет, получают недостаточно четкийрезультат, необходимо пересеять культуру со среды Эндо на питательный агар.После инкубации тест повторяют.
8.2.3.3. Определение принадлежности к Граму
Из оксидазоотрицательнойколонии делается мазок, окрашивается по Граму и микроскопируется.
На обезжиренное спиртомпредметное стекло наносят петлей 1 каплю дистиллированной воды, вносятнебольшое количество культуры из анализируемой колонии и распределяют поповерхности стекла. Мазок высушивают при комнатной температуре и фиксируюттрехкратным проведением через пламя горелки. На препарат накладывают полоскуфильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор генциана фиолетовогона (0,5 — 1) мин, снимают бумагу, наливают раствор Люголя на (0,5 — 1) мин,сливают раствор Люголя и стекло промывают в этиловом спирте в течение (0,5 — 1)мин, пока не перестанет отходить краситель. Затем стекло тщательно промываютводой и докрашивают в течение (1 — 2) мин фуксином Циля, разведенным 1:10дистиллированной водой. После промывания и просушивания препарата мазокмикроскопируют.
Приготовление реактивов дляокраски по Граму изложено в п. 5.9.
Грамотрицательныемикроорганизмы имеют розовую окраску, грамположительные окрашиваются в синийцвет. Колиформные бактерии являются грамотрицательными палочками.
Окраска по Граму может бытьзаменена тестом Грегерсена, не требующим использования оптики.
Тест Грегерсена: в капле 3%-ного водного раствора КОН на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу,взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесьослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежностьиспытуемой культуры или колонии к грамотрицательному виду. У грамположительныхбактерий слизистые нити не образуются — реакция отрицательная.
8.2.3.4. Определениеферментации лактозы
Оставшуюся частьоксидазоотрицательной грамотрицательной изолированной колонии засеваютпараллельно в две пробирки с лактозной средой (п. 5.6):
· для подтверждения наличия ОКБпосев инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 48 ч;
· для подтверждения наличия ТКБпосев осуществляют в среду, предварительно прогретую до температуры (43 — 44)°С, и инкубируют при температуре (44 ± 0,5) °С в течение 24 ч.
Первичный учет образованиякислоты и газа на подтверждающих полужидких средах и СИБ (п. 5.6)возможен через (4 — 6) ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительныйответ. При отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты пробирки спосевами для окончательного учета ТКБ оставляют до 24 ч. Пробирки с посевамидля подтверждения наличия ОКБ после просмотра через 24 ч и полученияотрицательного результата оставляют для окончательного учета до 48 ч.
Если колония, подлежащаяисследованию, незначительных размеров, ее пересевают на скошенный питательныйагар и после инкубации в течение (18 — 24) ч выполняют все необходимыеподтверждающие тесты.
8.2.3.5.Постановка подтверждающих тестов при наложении колоний или сплошном росте
Если на части или на всейповерхности фильтра наблюдается наложение колоний или сплошной рост, выполняютоксидазный тест путем помещения мембранного фильтра на кружок фильтровальнойбумаги большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивом, или на дискСИБ-оксидаза, смоченный дистиллированной водой. При появлении первых признаковреакции, но не более чем через 5 мин, мембранный фильтр переносят обратно насреду Эндо. После четкого проявления реакции определяют результат. Припоявлении фиолетово-коричневого или синего окрашивания (в зависимости отпримененного реактива) оксидазный тест считают положительным.
Если на фильтрах все колонииоксидазоположительные, они не учитываются и выдают ответ об отсутствии ОКБ иТКБ и завершают анализ.
При отрицательной оксидазнойреакции проводят рассев до получения изолированных колоний и подтверждают ихпринадлежность к ОКБ и ТКБ по п. п. 8.2.3.3 — 8.2.3.4 (анализ качественный).
8.2.4. Учет результатов
8.2.4.1. Грамотрицательныеколонии учитываются как ОКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментациилактозы при температуре 37 °С с образованием кислоты и газа.
Грамотрицательные колонииучитываются как ТКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозыпри температуре 44 °С с образованием кислоты и газа.
8.2.4.2. При отсутствии общихи термотолерантных колиформных бактерий на всех фильтрах результат записывают«не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 мл» и «не обнаружено КОЕ ТКБ в 100 мл».
8.2.4.3.В случае идентификации всех выросших подозрительных колоний число колониеобразующихединиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕв 100 мл воды.
Вычисление проводят поформуле:
, где
Х — число колоний в 100 мл;
V -профильтрованный объем воды через фильтры, на которых велся учет;
а — число подсчитанных на этихфильтрах колоний в сумме.
Примеры:
1. При посеве 3 фильтров по100 мл выросло две колонии в 100 мл, на остальных двух фильтрах нет роста.Число общих или термотолерантных колиформных бактерий будет:
КОЕ ОКБ (ТКБ) в 100 мл
2. При посеве 10, 40, 100 и150 мл на фильтрах с профильтрованным объемом 40 мл выросло 4 изолированныеколонии, с профильтрованным объемом 100 — 3 ОКБ. Фильтры с объемами 10 мл и 150мл заросли и учету не подлежат. Суммируют общее число колоний ОКБ (ТКБ) на техфильтрах, где получены изолированные колонии, и пересчитывают на объем 100 мл.
КОЕ в 100 мл
8.2.4.4. Если при выборочной проверкеколоний одного типа получены неодинаковые результаты, то вычисляют числа ОКБили ТКБ среди колоний этого типа по формуле:
, где
Х — число подтвержденныхбактерий одного типа;
а — общее число колоний этоготипа;
b- число проверенныхиз них;
с — число колоний сположительным результатом.
Полученные результаты учетапо каждому типу колоний суммируют и далее подсчитывают по п. 8.2.4.3 -8.2.4.4.
8.2.4.5. Окончательный результатвыдают: количество КОЕ ОКБ в 100 мл, из них количество КОЕ ТКБ в 100 мл.
Ориентировочный результатможет быть выдан при обнаружении типичных колиформных колоний на среде Эндо,образованных грамотрицательными оксидазоотрицательными бактериями. Окончательныйответ подтверждается по результатам ферментации лактозы.
8.2.4.6. При наложенииколоний или сплошном росте на всех фильтрах (п. 8.2.3.5) в случаеподтверждения принадлежности к ОКБ и ТКБ выдается качественный результат«обнаружено ОКБ в 100 мл».
Если все колонии на фильтреоксидазоположительные или не подтвердилась их принадлежность к ОКБ и ТКБ,анализ завершается, в протоколе отмечают «зарост фильтров».
В обоих случаях анализповторяют.
8.3. Определение общих и термотолерантныхколиформных бактерий титрационным методом
8.3.1. Определение понятияпоказателя
Определение понятияпоказателей ОКБ и ТКБ по п. 8.2.1.
8.3.2. Область применения
Титрационный метод может бытьиспользован:
· при отсутствии материалов иоборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации;
· при анализе воды с большимсодержанием взвешенных веществ;
· в случае преобладания в водепосторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированныхколоний общих колиформных бактерий.
8.3.3. Принцип метода
Метод основан на накоплениибактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду, споследующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозойи идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам.
8.3.4. Выполнение анализа
При исследовании питьевойводы качественным методом (текущий санэпиднадзор, производственныйконтроль) засевают 3 объема по 100 мл.
При исследованиях воды сцелью количественного определения ОКБ и ТКБ при повторном анализепроизводят посев: 3 объемов по 100 мл, 3 объемов по 10 мл, 3 объемов по 1 мл.
Каждый объем исследуемой водызасевают в лактозо-пептонную среду, приготовленную по п. 5.5. Посев 100 мл и 10 млводы производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1мл пробы проводят в 10 мл среды обычной концентрации.
Посевы инкубируют при (37 ±1) °С в течение 48 ч. Не ранее 24 час инкубации проводят предварительную оценкупосевов. Из емкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образованиегаза, производят высев бактериологической петлей на сектора среды Эндо (п. 5.4.1)для получения изолированных колоний.
Емкости без наличия роста иобразования газа оставляют в термостате и окончательно просматривают через 48ч. Посевы без признаков роста считают отрицательными и дальнейшему исследованиюони не подлежат. Из емкостей, где отмечено помутнение и образование газа илитолько помутнение, делают высев на сектора среды Эндо.
Посевы на среде Эндоинкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (18 — 20) ч.
При образовании помутнения игаза в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных длялактозоположительных бактерий: темно-красных или красных, с металлическимблеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательнойсреде, дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий вданном объеме пробы.
Наличие ОКБ требуетсяподтвердить:
· если в среде накопленияотмечено только помутнение;
· если принадлежность клактозоположительным колониям вызывает сомнение у исследователя.
В этих случаях:
· проверяют наличие отпечаткана среде Эндо после снятия петлей подозрительной колонии;
· выполняют оксидазный тест по п. 8.2.3.2;
· подтверждают принадлежность кГраму по п.8.2.3.3;
· подтверждают способность кгазообразованию при посеве изолированных 1 — 2 колоний каждого типа с каждогосектора на среду с лактозой по п. 5.6 с последующей инкубацией посевов притемпературе (37 ± 1) °С в течение (24 — 48) ч.
При отсутствии изолированныхколоний проводят рассев на среду Эндо общепринятыми бактериологическимиметодами.
Отрицательный ответ дают,если:
· в среде накопления нетпризнаков роста;
· на секторах среды Эндо нетроста;
· на секторах среды Эндовыросли не характерные для колиформных бактерий колонии (прозрачные с неровнымикраями, расплывчатые и т.п.);
· все колонии оказалисьоксидазоположительными;
· все колонии оказалисьграмположительными;
· если в подтверждающем тестена среде с углеводом не отмечено газообразования.
Для определения термотолерантныхколиформных бактерий работают с секторами среды Эндо, где выросли типичныелактозоположительные колонии. Делают посев 2 — 3 изолированных колоний каждоготипа с каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред, приготовленных по п. 5.6.
Среду перед посевом нагреваютна водяной бане или в термостате до 44 °С. Немедленно после посева пробиркипомещают в термостат и инкубируют при температуре (44 ± 0,5) °С в течение 24 ч.Допускается просмотр посевов через (4 — 6) ч.
При образовании газа в среденакопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявленииспособности этих бактерий ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24ч при температуре 44 °С дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробыводы ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательный ответ.
Допустимо для ускорениявыдачи ответа на присутствие ТКБ производить высев 1 мл из объемов среды накопления,где отмечено помутнение и газообразование в пробирке с лактозо-пептонной средойс поплавком по п.5.6 и прогретой предварительно до температуры 44 °С. Посевывыдерживают в термостате при температуре (44 ± 0,5) °С в течение 24 ч. Приобнаружении кислоты и газа дают положительный ответ.
8.3.5. Учет результатов
При исследовании 3 объемов по100 мл результаты оцениваются качественно и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы водном из 3 объемов, делается запись в протоколе «обнаружены в 100 мл».
При исследованииколичественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ по табл. 1.1приложения1.
Результат сообщают бездоверительного интервала.
При отрицательном ответе наналичие ОКБ и ТКБ во всех исследованных объемах выдают заключение в протоколе«не обнаружены в 100 мл».
8.4. Определение спор сульфитредуцирующихклостридий
8.4.1. Определение понятияпоказателя
Сулъфитредуцирующиеклостридии -спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, редуцирующие сульфитнатрия на железо-сульфитном агаре при температуре (44 ± 1) °С в течение (16 -18) ч.
8.4.2. Принцип метода
Метод основан на выращиваниипосевов в железо-сульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, иподсчете числа черных колоний.
8.4.3. Выполнение анализа
8.4.3.1.Пробу воды 20 мл прогревают на водяной бане в пробирках при температуре (75 ±5) °С в течение 15 мин для исключения вегетативных форм.
При исследованиихлорированной воды прогревание пробы можно не производить.
Из каждой пробы питьевой водыделают посев или фильтруют 20 мл. При необходимости подбирают объемы с такимрасчетом, чтобы в посевах (на фильтрах) выросло не более 10 — 15 колоний. Приэтом ориентируются на результаты предыдущих исследований.
Фильтрование воды производятв соответствии с требованиями, изложенными в п. 7.
8.4.3.2. Определение методомфильтрования в пробирках
Перед посевом пробирки сжелезо-сульфитным агаром, приготовленным по п. 5.8, расплавляют на водянойбане (не кипятить!). В течение посева поддерживают среду нагретой до (70 — 80)°С в водяной бане.
После фильтрованияустановленного объема воды мембранный фильтр фламбированным пинцетом берут задва противоположных края и согнутый в виде трубочки помещают в пробирку сгорячим агаром. Сторона фильтра с осевшими бактериями обращена внутрь. При этомфильтр распрямляется и располагается по стенке пробирки.
Сразу же после посевапробирку с агаром и фильтром для создания анаэробных условий быстро охлаждают,помещая в емкость с холодной водой. Культивируют посевы при (44 ± 1) °С втечение (16 — 18) ч.
8.4.3.3. Определение методомфильтрования в чашках Петри
Чашки Петри диаметром (55 -60) мм заливают тонким слоем железо-сульфитного агара. После фильтрациифильтр поместить фильтрующей поверхностью вниз на застывшую питательную средутак, чтобы под фильтром не было пузырьков воздуха. Затем заливают расплавленнымжелезо-сульфитным агаром до верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегалак среде для создания анаэробных условий. Культивируют посевы при (44 ± 1) °С втечение (16 — 18) ч.
8.4.3.4. Определение прямымпосевом
Железо-сульфитный агар вофлаконах и пробу воды готовят, как это описано в п. 8.4.3.1.
В стерильные пробирки вносят:
· по 10 мл в 2 пробирки(объемом не менее 30 мл) или
· по 5 мл в 4 пробирки (объемомпо 15 мл).
Посевы заливают горячимжелезо-сульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Средузаливать по стенке пробирки, избегая образования пузырьков воздуха. После этогопробирку быстро охлаждают, помещая ее в емкость с холодной водой для созданияанаэробных условий. Посевы инкубируют при (44 ± 1) °С в течение (16 — 18) ч.
8.4.4. Учет результатов
Количественному учетуподлежат только те посевы, где получены изолированные колонии. Подсчитываютчерные колонии, выросшие как на фильтрах, так и в толще питательной среды.
Результат анализа выражаютчислом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфитредуцирующих клостридий в 20мл воды.
При отсутствии роста черныхколоний на всех фильтрах дают ответ «не обнаружено в 20 мл воды».
При невозможности учетаколоний из-за сливного роста результат оценивается как качественный, впротоколе отмечают «обнаружено в 20 мл». При необходимости полученияколичественного результата анализ повторяют.
8.5. Определение колифагов
8.5.1. Определение понятияпоказателя
Колифаги — бактериальные вирусы,способные лизировать E. coli и формировать при температуре (37 ± 1) °С через(18 ± 2) ч зоны лизиса бактериального газона (бляшки) на питательном агаре.
8.5.2. Титрационный методопределения колифагов
8.5.2.1. Принцип метода
Определение колифагов впитьевой воде заключается в предварительном накоплении колифагов в средеобогащения на культуре E. coli и последующем выявлении зон лизиса(просветления) газона E. coli на питательном агаре.
8.5.2.2. Область применения
Метод предназначен дляпроведения текущего контроля качества питьевой воды.
8.5.2.3.Подготовка тест-культуры E. coli К12 StrR.
На всех этапах исследованияиспользуют бактериальную взвесь, приготовленную следующим образом: культуру E.coli засевают в пробирку со скошенным питательным агаром со стрептомицином(п. 5.3.5).Через (18 ± 2) ч инкубации при температуре (37 ± 1) °С произвести смыв бактерийс косяка 5 мл стерильного физиологического раствора (0,85 %-ный раствор NaCl) ипо стандарту мутности готовят взвесь E. coli в концентрации 109бактериальных клеток в 1 мл.
Допускается использование4-часовой бульонной культуры E. coli, полученной путем подращивания втермостате при температуре 37 °С. Концентрация 109 бактериальныхклеток E. coli содержится в 2 мл.
8.5.2.4. Проведениекачественного анализа
В исследуемую пробу водыобъемом 100 мл вносят 10 мл 10-кратного питательного бульона (приготовленногопо п. 5.2.2)и 1 мл подготовленного смыва тест-культуры или 2 мл 4-часовой бульоннойкультуры (п.8.5.2.3).
Для контроля культуры 0,1 млсмыва бактерий Е. coli (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) помещают вчашку Петри и заливают питательным агаром.
Исследуемую пробу воды (100мл) и чашку Петри с контролем E. coli помещают в термостат и инкубируют притемпературе (37 ± 1) °С в течение (18 ± 2) ч.
После инкубации изисследуемой пробы воды отливают в пробирку 10 мл и добавляют 1 мл хлороформа.
Пробирку закрывают стерильнойрезиновой или силиконовой пробкой, энергично встряхивают для равномерногораспределения хлороформа по объему пробы и оставляют при комнатной температурене менее 15 мин до полного осаждения хлороформа.
В предварительнорасплавленный и остуженный до (45 — 49) °С питательный агар добавляютприготовленный смыв бактерий E. coli (п. 8.5.2.3) из расчета 1,0мл смыва (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры) на 100 мл агара.
В стерильную чашку Петрипипеткой из пробирки переносят 1 мл обработанной хлороформом пробы (не касаясьхлороформа) и заливают смесью расплавленного и остуженного до (45 — 49) °Спитательного агара объемом (12 — 15) мл, а также одну дополнительную чашкуПетри для контроля культуры E. coli и осторожно покачивают для равномерногоперемешивания пробы воды и агара. Для полного застывания чашки оставляют настоле при комнатной температуре на 10 мин. После застывания чашкипереворачивают и помещают в термостат на (18 ± 2) ч при 37 °С.
При выполнении серии пробставится общий контроль для всей серии.
Учет результатов
Просмотр посевов осуществляютв проходящем свете.
Проба считается положительнойпри наличии полного лизиса, просветления нескольких бляшек, одной бляшки начашке с пробой воды при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке.
В протоколе анализаотмечается: колифаги обнаружены или не обнаружены в 100 мл воды (результаткачественный).
При наличии зон лизиса вконтроле культуры результат считается недействительным.
8.5.2.5.Проведение количественного анализа
Исследуемую пробу воды вколичестве 100 мл разлить на 6 объемов: 1 флакон 50 мл и 5 пробирок по 10 мл. В50 мл пробы добавить 5 мл десятикратного питательного бульона (по п. 5.2.2)и 0,5 мл смыва (или 1 мл 4-часовой бульонной культуры) бактерий E. coli(п.8.5.2.3). В каждые 10 мл пробы внести по 1 мл десятикратногопитательного бульона и 0,1 мл смыва (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры)бактерий E. coli.
Для контроля культуры 0,1 млсмыва бактерий (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) E. coli помещают вчашку Петри и заливают питательным агаром.
Посевы инкубируют притемпературе (37 ± 1) °С в течение 18 ± 2 ч.
После инкубации из объема 50мл отлить в пробирку 10 мл. Во все исследуемые 6 объемов добавить по 1 млхлороформа. Пробирки закрыть стерильными резиновыми или силиконовыми пробками,энергично встряхнуть для равномерного распределения хлороформа по объему пробыи оставить при комнатной температуре не менее 15 мин для осаждения хлороформа.
В предварительнорасплавленный и остуженный до (45 — 49) °С питательный агар добавить приготовленныйсмыв бактерий E. coli (п. 8.5.2.3) из расчета 1,0 мл смыва (или 2 мл4-часовой бульонной культуры) на 100 мл агара. Приготовленную смесь разлить вчашки Петри: 1 чашку для контроля культуры E. coli на лизогенность и по однойчашке на каждую исследуемую пробу воды. При одновременном анализе несколькихпроб воды ставится один контроль культуры E. coli.
После застывания агара чашки,предназначенные для посева проб, разделить на 6 секторов, промаркировать их всоответствии с исследуемыми объемами. На каждый сектор из соответствующейпробирки нанести пастеровской пипеткой (микропипеткой или бактериологическойпетлей продольным штрихом) по 1 капле надосадочной жидкости (без хлороформа).
После подсыхания капель чашкис исследуемыми пробами и контрольную чашку поместить в термостат при (37 ± 1)°С на (18 ± 2) ч.
Учетрезультатов
Просмотр результатовосуществляется в проходящем свете.
Учет проводится по наличиюзон просветления (лизиса) на секторах газона E. coli.
При применении капельногоспособа посева пипеткой образуется зона лизиса в виде округлого пятна илиотдельных бляшек. При посеве продольным штрихом бактериологической петлейотмечается лизис по ходу штриха.
Проба считается положительнойпри наличии зоны лизиса хотя бы на одном секторе при отсутствии зон лизиса наконтрольной чашке.
Оценка проводится по таблиценаиболее вероятного числа (НВЧ) бляшкообразующих единиц (БОЕ) (табл. 1.2). Впротоколе анализа указывается наиболее вероятное количество колифагов в 100 млводы и диапазон возможных колебаний: НВЧ БОЕ (нижний предел — верхний предел)колифагов в 100 мл. Результат полуколичественный.
При наличии зон лизиса вконтрольной чашке результат считать недействительным.
8.5.3. Прямой методопределения колифагов
8.5.3.1. Принцип метода
Определение колифагов впитьевой воде заключается в исследовании нормируемого объема воды (100 мл)путем его прямого посева и последующего учета зон лизиса (бляшек) на газоне E.coli в чашках Петри с питательным агаром.
8.5.3.2. Область определения
Прямой метод выделенияколифагов из воды проводят параллельно с титрационным при исследованиях поэпидемическим показаниям.
8.5.3 3. Проведение анализа
В питательный агар двойнойконцентрации (п.5.3.2), расплавленный и остуженный до (45 — 49) °С, добавить смыв E.coli (п.8.5.2.3) из расчета 2,0 мл смыва (или 4 мл 4-часовой бульонной культуры)на каждые 100 мл агара, перемешать. Исследуемые 100 мл воды разлить по 20 мл вбольшие пробирки, нагреть до (35 — 44) °С и немедленно (не более чемчерез 5 мин по достижении требуемой температуры) разлить в 5 чашек Петри исразу же внести в каждую чашку по 20 мл смеси агара с культурой E. coli.
Для контроля культуры E. coliв одну чашку Петри внести 20 мл стерильной водопроводной воды, предварительнопрогретой до (35 — 44) °С, залить 20 мл приготовленного агара с E. coli иосторожно перемешать.
Содержимое чашек осторожноперемешать и оставить при комнатной температуре до застывания. Чашки сзастывшим агаром поместить дном вверх в термостат и инкубировать притемпературе (37 ± 1) °С в течение (18 ± 2) ч.
Учет результатов
Просмотр посевов осуществляетсяв проходящем свете.
Учет результатов проводятпутем подсчета и суммирования бляшек, выросших на 5 чашках Петри. Результатывыражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 мл пробы воды. В контрольнойчашке бляшки должны отсутствовать.
Наиболее часто зоны лизисавыглядят прозрачными пятнами на фоне газона тест-культуры питательного агара ввиде круглых изолированных бляшек (от 1 до 5 — 7) мм в диаметре с четковыраженными либо стертыми границами.
При высоких концентрацияхфага наблюдается разная картина лизиса.
Слияние негативных колонийдает «ажурный» газон E. coli, рост единичных колоний E. coli на фоне сплошноголизиса, либо полное отсутствие роста на чашке.
При прямом посеве возможенлизис, маскируемый негомогенно застывшим агаром, а также закрытый сопутствующеймикрофлорой. Капли конденсата и негомогенно застывший при прямом посеве агармогут приводить к образованию артефактов на газоне E. coli, визуальнонапоминающих лизис.
Предварительный учетрезультатов можно проводить через (5 — 6) ч инкубации. На этом этапе приналичии четких зон лизиса может быть выдан предварительный ответ о присутствииколифагов в воде.
Окончательный количественныйучет прямого посева проводится через (18 ± 2) ч. Результаты выражаютколичеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 100 мл пробы воды.
Если отмечен сливной ростбляшек и счет затруднителен, то по данным прямого посева может быть выданкачественный результат: «обнаружено в 100 мл воды».
При получении отрицательногорезультата при работе прямым методом окончательный ответ выдается порезультатам титрационного метода.
При наличии зон лизиса вконтрольной чашке результат исследования считается недействительным.
8.5.4. Постановка контролей
8.5.4.1. Отрицательныйконтроль
Отрицательный контрольподтверждает отсутствие контаминации фагом питательных сред, лабораторнойпосуды, оборудования на этапах подготовки и проведения анализа, а такжепозволяет оценить способность тест-культуры E. coli давать равномерный газон.
Отрицательным контролемслужит исследование стерильной водопроводной воды, проводимое аналогичноанализируемой пробе воды. Так, при анализе воды титрационным методом 10 млстерильной водопроводной воды вносят в дополнительную пробирку. При анализеводы прямым посевом в дополнительную шестую чашку Петри вносят 20 мл стерильнойводопроводной воды.
Дополнительные посевыисследуются на колифаги аналогично основным пробам.
При анализе серии проботрицательный контроль может быть один на каждый вид анализа: титрационный ипрямой. В этом случае постановка отрицательного контроля поэтапноосуществляется после обработки всех проб данной серии.
В случае обнаружения бляшекколифагов в чашках с отрицательным контролем результаты исследования всей сериипроб воды недействительны.
Следует проверитьстерильность лабораторного оборудования, посуды, питательных сред, а такжеповторить контрольный посев на чистоту тест-штамма E. coli К12 F+ StrR.
Кратность проведенияотрицательного контроля — 1 раз в день.
8.5.4.2. Методикаподтверждения фаговой природы лизиса
В сомнительных случаях приработе как титрационным, так и прямым методами необходимо провести контрольныйпосев на подтверждение фаговой природы лизиса.
С этой цельюбактериологической петлей извлекают участок агара, подозрительный на колифаги,помещают его в 5 мл питательного бульона, куда добавляют каплю тест-культуры E.coli и инкубируют при 37 °С в течение (16 — 18) ч. Полученную культуруобрабатывают хлороформом и исследуют на наличие фага. Высев осуществляют петлейили пипеткой на сектора питательного агара аналогично способу, описанному в п. 8.5.2.5.Лизис на любом из секторов расценивается как подтверждение наличия фага.
Приложения
Приложение1
Таблицы расчета наиболеевероятного числа микроорганизмов
Таблица 1.1
Расчет наиболее вероятногочисла бактерий в 100 мл питьевой воды
Число положительных результатов из:
НВЧ бактерий в 100 мл
Доверительный интервал (95 %)
3 объемов по 100 мл
3 объемов по 10 мл
3 объемов по 1 мл
нижний
верхний
1
2
3
4
5
6
0
0
1
0,3
0
1,4
0
0
2
*1
0
0
3
*
0
1
0
0,3
0,1
1,4
0
1
1
*
0
1
2
*
0
1
3
*
0
2
0
0,6
0,1
2,8
0
2
1
*
0
2
2
*
0
2
3
*
0
3
0
*
0
3
1
*
0
3
2
*
0
3
3
*
1
0
0
0,4
0,1
1,7
1
0
0
0,7
0,2
3,4
1
0
2
*
1
0
3
*
1
1
0
0,7
0,2
3,4
1
1
1
1,1
0,2
5,2
1
1
2
*
1
1
3
*
1
2
0
1,1
0,2
5,3
1
2
1
*
1
2
2
*
1
2
3
*
1
3
0
*
1
3
1
*
1
3
2
*
1
3
3
*
2
0
0
0,9
0,2
4,3
2
0
1
1,4
0,3
6,7
2
0
2
*
2
0
3
*
2
1
0
1,5
0,3
6,9
2
1
1
2
0,4
9,6
2
1
2
*
2
1
3
*
2
2
0
2
0,5
9,9
2
2
1
3
0,6
12,9
2
2
2
*
2
2
3
*
2
3
0
3
0,6
13,3
2
3
1
*
2
3
2
*
2
3
3
*
3
0
0
2
0,5
10,8
3
0
1
4
0,8
18,0
3
0
2
6
1,4
29,7
3
0
3
*
3
1
0
4
0,9
20,0
3
1
1
8
1,6
35,0
3
1
2
12
2,5
53,8
3
1
3
*
3
2
0
9
2,0
43,6
3
2
1
15
3,2
69,8
3
2
2
21
4,6
100,3
3
2
3
29
6,2
136,4
3
3
0
24
5,1
112,1
3
3
1
46
9,3
216,0
3
3
2
110
23,5
516,6
3
3
3
> 240
—
—
1 Вероятность ниже допустимогоуровня. Количественный учет невозможен, результат оценивается качественно.
Таблица 1.2
Расчет наиболее вероятного числа (НВЧ) колифагов в 100 мл
Наиболее вероятное число(НВЧ) в 100 мл
Числоположительных результатов
НВЧ в100 мл
Вероятность
Нижний
предел
Верхний
предел
из 1объема по 50 мл
из 5объемов по 10 мл
1
4
16,1
0,4095
1,9
113,9
1
3
9,3
0,3422
1,1
77,4
1
2
5,6
0,3218
0,7
46,4
1
1
3,2
0,3039
0,4
26,2
1
0
1,4
0,2500
0,2
11,5
0
5
6,9
0,0010
0,8
57,6
0
4
5,1
0,0060
0,6
42,5
0
3
3,6
0,0222
0,4
29,6
0
2
2,2
0,0671
0,3
18,5
0
1
1,1
0,1937
0,1
8,8
Приложение 2
(обязательное)
Ведение эталонных культур
Ведение эталонных культуробеспечивает максимальное сохранение типовых свойств штаммов, что достигаетсясоблюдением принципов их культивирования, контроля и хранения.
Согласно санитарным правиламСП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортированиямикроорганизмов III — IV групп патогенности», п. 3.1.6 «Производственнымпредприятиям, контролирующим готовую продукцию, разрешается иметь толькоколлекцию типовых культур, предусмотренных нормативно-техническойдокументацией».
Хранение культуросуществляется в соответствии с п. 3.2.12 СП1.2.036-95. Лаборатория должна иметь разрешение на работу с микроорганизмамиIII — IV групп патогенности.
1. Ведениебактериальных культур аэробов и факультативных анаэробов
Основные положения
В качестве контрольныхтест-штаммов используют эталонные культуры, полученные из официально признаннойколлекции микроорганизмов (п. 4.5).
Хранение запасов рабочейкультуры осуществляется в столбике полужидкого агара, срок хранения 3 мес.
Для целевого использованияпригодна суточная («ночная») культура эталонного штамма, прошедшая не более2 пассажей на питательных средах, с момента высева со среды дляхранения запасов рабочей культуры.
Восполнение запасов рабочейкультуры допускается не более трех раз. В этой связи срок использованияэталонной культуры с момента вскрытия ампулы — 1 год.
На этапах восстановления излиофилизированного состояния и восполнения запасов рабочих культуросуществляется контроль сохранения видовых и паспортных свойств тест-культуры.
Культура с измененнымисвойствами в анализе не используется.
По истечении года необходимополучить новую лиофилизированную эталонную культуру из коллекциимикроорганизмов.
Процедура ведения культурывключает следующие этапы:
· восстановлениелиофилизированной культуры;
· создание и хранение запасоврабочей культуры;
· восполнение запасов рабочейкультуры;
· подготовка культуры дляцелевого использования в анализе;
· контроль видовых и паспортныхсвойств.
1.1. Восстановлениелиофилизированной эталонной культуры
Оттянутый конец ампулы слиофилизированной культурой нагревают над пламенем горелки. Влажным концомстерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чегопоявляются трещины. Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой,смоченной 70 °-ным этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом.
После вскрытия ампулаостается накрытой той же салфеткой в течение (1 — 2) мин. Затем салфеткуосторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулувносят ≈ 0,5 мл питательного бульона (п. 5.2.1) для регидратации.Содержимое ампулы перемешивают, переносят стерильной пастеровской пипеткой илишприцем в пробирку с питательным бульоном и инкубируют при (37 ± 1) °С втечение 18 — 24 ч.
После инкубации изпитательного бульона делают высев петлей на скошенный питательный агар в двепробирки (п.5.3.1).
При восстановлении штамма E.coli К12 F+ StrR посев осуществляется наскошенный питательный агар, содержащий стрептомицин (п. 5.3.5).
Посевы инкубируют при 37 °С втечение (18 — 24) ч.
Одну пробирку с посевомиспользуют для постановки тестов на соответствие полученного штамма видовым,паспортным свойствам (п. п. 1.5.2 — 1.5.5 приложения 2).
Второй посев на скошенном питательномагаре используют для создания запасов рабочей культуры (п. 1.2 приложения 2).
Оставшуюся бульонную культуруE. coli М17-02 используют для оценки степени диссоциации эталонного штамма, какэто описано в пункте1.5.1 приложения 2.
При несоответствии штаммавидовым и паспортным свойствам и (или) при наличии более 25 % полиморфных(нетипичных) колоний в R-форме полученную культурудля работы не используют.
1.2. Создание запасов рабочей культуры
При удовлетворительномпрохождении контрольных тестов (п. п. 1.5.1 — 1.5.5 приложения 2) культуру соскошенного питательного агара (для E. coli К12 F+ StrR — с питательного агара сострептомицином) засевают уколом в столбик с полужидким агаром (п. 5.3.4).В зависимости от интенсивности работы лаборатории посев проводят в 4 — 10пробирок, из расчета по 1 — 3 пробирки на 1 мес. работы и 1 пробирки длявосполнения запасов рабочей культуры через 3 мес. на следующий квартал (п. 1.3 приложения 2).
Посевы инкубируют (18 — 24) чпри 37 °С. При наличии роста пробирки закрывают резиновыми (силиконовыми)пробками и закладывают на хранение при температуре (4 — 8) °С.
Одну из пробирок с культурой,предназначенной для восполнения рабочих запасов, маркируют и хранят отдельно.Запасы рабочей культуры желательно хранить в отдельном холодильнике.
1.3.Восполнение запасов рабочей культуры
Восполнение запасов рабочейкультуры производится в конце третьего, шестого и девятого месяца с моментавскрытия ампулы (каждые 3 мес.).
Для восполнения запасоврабочей культуры используется субкультура на среде хранения, полученная ранеепри создании запасов или при очередном их восполнении.
Из пробирки с культурой,предназначенной для восполнения запасов, производят посев в питательный бульон.Посевы инкубируют при 37°С (18 — 24) ч.
После инкубации изпитательного бульона делают высев петлей в две пробирки со скошеннымпитательным агаром (п. 5.3.1). При ведении штамма E. coli К12 F+ StrR посев осуществляется наскошенный питательный агар, содержащий стрептомицин (5.3.5). Посевы инкубируютпри 37 °С (18 ± 2) ч.
Один из посевов используютдля постановки тестов на соответствие полученного штамма видовым, паспортнымсвойствам (п.п.1.5.2 — 1.5.5 приложения 2).
Второй посев на скошенномпитательном агаре используют для восполнения запасов рабочей культуры (п. 1.2 приложения 2).
Оставшуюся бульонную культуруE. coli М17-02 используют для оценки степени диссоциации эталонного штамма, какэто описано в п.1.5.1 приложения 2.
При наличии более 25 %полиморфных (нетипичных) колоний и (или) при несоответствии штамма видовым ипаспортным свойствам полученную культуру для дальнейшей работы не используют.
Необходимо получить новуюампулу с эталонной культурой и начать процедуру ведения тестового штаммасначала.
При удовлетворительномпрохождении контрольных тестов процедура закладки культуры на хранениеосуществляется согласно п. 1.2 приложения 2.
Восполнение запасов рабочей культурыпроводят только три раза. По истечении года использования необходимо получитьновую эталонную культуру из коллекции микроорганизмов.
1.4. Подготовка культуры дляцелевого использования в анализе
Накануне использованиякультуру с полужидкого агара высевают на 2 пробирки со скошенным питательнымагаром (п.5.3.1). Для культуры E. coli К12 F+ StrR используют питательный агарсо стрептомицином (п. 5.3.5). Посев инкубируют (18 — 24) ч при37 °С.
Культуру из одной пробиркииспользуют по назначению. Вторая пробирка с культурой на скошенном питательномагаре используется для получения культуры для работы на следующий (второй)день.
При необходимости получения культурытест-штамма на третий день высев снова производят с полужидкого агара.
1.5. Контроль эталонныхбактериальных культур
Постановка контроля включает:
· оценку степени диссоциациикультуры E. coli М17-02;
· проверку видовых свойствбактериальных культур;
· проверку способности E. coliК12 F+ StrR проверку культуры E. coli К12 F+ StrR на однородность и отсутствиезагрязнения фагом.
1.5.1.Оценка степени диссоциации культуры E. coli М 17-02
Из 18-часовой бульоннойкультуры делают 10-кратные разведения физиологическим раствором. По 0,1 мл из 5и 6 разведения засевают на 2 чашки питательного агара предварительноподсушенные в термостате. Шпателем посевы распределяют по поверхности агара дополного исчезновения влаги и инкубируют в термостате при температуре (37 ± 1)°С в течение (18 — 24) ч.
Выбирают чашки, на которыхвыросло от 30 до 100 колоний.
Проверку тест-штаммов надиссоциацию производят путем визуального просмотра изолированных колоний начашках в прямом и косонаправленном свете через бинокулярную лупу или микроскопна малом увеличении.
На питательном агаре бактериивида E. coli образуют колонии средней величины (3 — 5) мм, плоско-выпуклые,круглые, гладкие с ровным краем (S-форма), влажные, блестящие, прозрачныев прямом и непрозрачные (опалово-мутные) в косопроходящем свете. Вкосопроходящем свете колонии эшерихий могут иметь равномерную зернистость.
В R-форме колонии эшерихий болееплоские, большего размера, неправильной формы с неровными краями и шероховатой,матовой поверхностью.
При наличии диссоциации (поразмеру, S-R-диссоциация, др.)подсчитывают количество измененных колоний и общее количество просмотренныхколоний. Общее количество просмотренных бактерий не должно быть менее 30. Затемрассчитывают процент диссоциации по формуле:
Если процент диссоциированныхколоний более 25 %, то данная культура не пригодна для дальнейшегоиспользования.
1.5.2.Контроль видовых свойств E. coli М17-02 и E. coli К12 F+ StrR
После восстановлениялиофилизированной культуры проводится типирование культуры по биохимическимсвойствам до вида.
Идентификацию рекомендуетсяпроводить с использованием тест-систем биохимической идентификации семейства Enterobacteriaceae, разрешенных к применению. При этом следует руководствоватьсярекомендациями производителя. Правомочна постановка отдельных биохимическихтестов.
Перед очереднымежеквартальным созданием запаса рабочей культуры оценку эталонного штамма E.coli проводят путем подтверждения следующих основных свойств:
· отсутствие оксидазнойактивности;
· грам-негативности;
· способности образовывать насреде Эндо характерные темно-красные (малиновые) колонии с металлическимблеском и отпечатком на среде;
· способности утилизироватьлактозу до кислоты и газа при температуре 37 °С в течение 24 — 48 ч и 44 °С втечение 24 ч;
· способности утилизироватьглюкозу до кислоты и газа при температуре 37 °С в течение 24 ч.
Если культура несоответствует видовым свойствам, то она не пригодна для дальнейшегоиспользования.
1.5.3. Проверкачувствительности E. coli К12 F+ StrR
Способность E. coli К12 F+ StrR лизироваться специфичнымфагом, является основополагающим свойством тест-культуры, на котором основанметод определения колифагов в воде.
Проверка чувствительностиосуществляется каждый раз, когда из запасов хранения берется новая пробирка срабочей культурой, хранящейся на полужидком агаре.
Выполнение анализа
Бактериальную взвесь готовятпо п. 8.5.2.3.На 100 мл расплавленного и остуженного до (45 — 49) °С питательного агаравносят 1 мл бактериальной взвеси и разливают в чашки. После застывания чашки наповерхность агара наносят каплю (0,05 мл) суспензии фага, не захватываяхлороформа. Инкубируют в течение 18 — 24 ч при 37 °С. Просмотр посевов следуетосуществлять в проходящем свете.
Культура считаетсявосприимчивой и пригодной для проведения анализов воды при наличии четких зонлизиса. При отсутствии зон лизиса культура не пригодна для использования иподлежит замене.
1.5.4.Проверка культуры E. coli К12 F+ StrR на загрязненность фагом
Бактериальную взвесь готовятпо п.8.5.2.3, вносят в расплавленный и остуженный до температуры (45 -49) °С питательный агар из расчета 1 мл взвеси на 100 мл агара. Чашку Петризаливают приготовленной смесью, инкубируют при температуре 37 °С (18 — 24) ч.
Просмотр посевов осуществляютв проходящем свете. Культура должна давать равномерный газон роста. Наличие зонлизиса в контроле свидетельствует о загрязненности культуры фагами.
1.5.5. Контроль видовыхсвойств Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens
Оценку эталонного штамма Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens проводят путем подтверждения следующихсвойств:
· наличия оксидазнойактивности;
· грам-негативности;
· роста на ПБ в видесеребристой пленки на поверхности с образованием кольца сине-зеленого пигмента;
· наличия сине-зеленогопигмента пиоцианина при росте на ПА при 37 °С;
· способности роста напитательном агаре при 42 °С в течение 24 ч (для Pseudomonas aeruginosa);
· способности роста напитательном агаре при 4 °С в течение 24 ч (для Pseudomonas fluorescens).
Если культура несоответствует видовым свойствам, то она не пригодна для дальнейшего использования.
2. Культивирование, хранениеи контроль эталонных культур бактериофагов
В качестве эталонного штаммадля проведения контроля культуры клеток-хозяина при проведении анализа наколифаги используется РНК-содержащий фаг MS2.
Процесс ведения эталонногоштамма колифага MS2 состоит из 2 функциональных блоков:
· восстановлениелиофилизированной культуры;
· создание запасов эталоннойкультуры и культур для целевого использования.
2.1. Восстановлениелиофилизированной культуры
Оттянутый конец ампулы слиофилизированными культурами нагревают над пламенем горелки. Влажным концомстерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чегопоявляются трещины.
Конец ампулы накрываюттрехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70 °-ным этиловым спиртом и хорошоотжатой, и обламывают пинцетом.
После вскрытия ампулаостается накрытой той же салфеткой в течение (1 — 2 мин). Затем салфеткуосторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулувносят 0,5 мл питательного бульона для регидратации.
2.2. Создание запасовэталонных культур фага и культур для целевого использования
Рабочую культуру E. coli К12 F+ StrR, хранящуюся на полужидкомагаре, засевают в пробирку с 10 мл питательного бульона. Посевы инкубируют при (37± 1) °С (18 — 24) ч.
После инкубации 0,1 млполученной бульонной культуры повторно засевают в 3 — 4 пробирки с 10 млпитательного бульона и помещают в термостат при (37 ± 1) °С. Через 2 часинкубации в каждую пробирку вносят регидрированную культуру фага МS2, инкубацию продолжают до (18- 24) ч. После инкубации в пробирку добавляют по 1 мл хлороформа, герметичноукупоривают, интенсивно встряхивают и оставляют на ночь в холодильнике.
Пипеткой отбирают бульон надосевшим хлороформом и переносят в стерильные пробирки, добавляют по 1 млхлороформа, герметично укупоривают, встряхивают и хранят в холодильнике.
Одну пробирку используют дляцелевого назначения в контроле чувствительности культуры E. coli К12 F+ StrR к фагу. Две других служатзапасом эталонного фага.
Активность полученнойкультуры определяется титром фага. Для использования допускается культура ститром более 107 — 108. Через год хранения титр фагаможет снизиться. В этой связи необходимо получить новую культуру или провестиопределение титра хранящегося фага.
2.3. Определение титра фага
Для определения титра фагавыполняется серия десятикратных разведении культуры фага (п. 2.2).По 1 мл каждого разведения вносят в чашки Петри и заливают смесью питательногоагара и E. coli К12 F+ StrR, приготовленной аналогичноописанному в п. 1.5.4приложения2. Посевы инкубируют при (37 ± 1) °С. Пробирки с разведениями закупориваютрезиновыми или силиконовыми пробками и хранят до получения результатов притемпературе (4 ± 2) °С для приготовления рабочих суспензий фага.
Через (18 — 24) ч инкубациипросчитывают количество бляшек на чашках. Учету подлежат чашки, на которыхотмечается рост 30 — 100 негативных колоний фага.
При получении титра менее 107фаг можно размножить. Для нарастания титра необходимо повторить описаннуюпроцедуру.
После выполнения работ с культурамифагов необходимо провести тщательную обработку помещения дезсредствами иобеззараживание ультрафиолетовым облучением.
Услуги по монтажу отопления водоснабжения
ООО ДИЗАЙН ПРЕСТИЖ 8(495)744-67-74
Кроме быстрого и качественного ремонта труб отопления, оказываем профессиональный монтаж систем отопления под ключ. На нашей странице по тематике отопления > resant.ru/otoplenie-doma.html < можно посмотреть и ознакомиться с примерами наших работ. Но более точно, по стоимости работ и оборудования лучше уточнить у инженера.
Для связи используйте контактный телефон ООО ДИЗАЙН ПРЕСТИЖ 8(495) 744-67-74, на который можно звонить круглосуточно.
Отопление от ООО ДИЗАЙН ПРЕСТИЖ Вид: водяное тут > resant.ru/otoplenie-dachi.html
Обратите внимание
Наша компания ООО ДИЗАЙН ПРЕСТИЖ входит в состав некоммерческой организации АНО МЕЖРЕГИОНАЛЬНАЯ КОЛЛЕГИЯ СУДЕБНЫХ ЭКСПЕРТОВ. Мы так же оказываем услуги по независимой строительной технической эесаертизе.